Ainda que a mastite por definição seja uma inflamação, na grande maioria das vezes é causada por infecções da glândula mamária.
Conhecer as causas de um problema é um dos pré-requisitos essenciais para escolher as melhores soluções para resolve-lo.
Esta informação é ainda mais crítica em relação às doenças multifatoriais como a mastite, que podem ter inúmeras causas, e desta forma, diferentes estratégias para o controle e tratamento.
Conceitualmente, a mastite é a inflamação da glândula mamária, que se manifesta na forma clínica (com sintomas visuais do leite ou do úbere) ou subclínica (somente com alterações da composição e CCS do leite).
Em termos de controle da mastite, um passo fundamental é a implantação de uma rotina de diagnóstico para obtenção de indicadores da situação da doença no rebanho. Por exemplo, recomenda-se que a mastite clínica seja diagnosticada em todas as ordenhas (pelo uso do teste da caneca de fundo preto) e mastite subclínica pela realização mensal de um teste para avaliar a CCS das vacas.
Ainda que a mastite por definição seja uma inflamação, na grande maioria das vezes é causada por infecções da glândula mamária, ou seja, pela presença de microrganismos, principalmente de bactérias, que invadem o úbere através do canal dos tetos. Desta forma, a manifestação da mastite na forma clínica ou subclínica vai depender da interação entre a resposta da vaca e a patogenicidade do microrganismo causador.
Atualmente, já foram identificados mais de 130 diferentes tipos de patógenos causadores de mastite, o que reforça a necessidade de diagnóstico das causas da mastite antes de tomar decisões de tratamento ou de controle.
Como não há relação entre o tipo de sintoma/manifestação da mastite e o tipo de microrganismo causador, somente é possível identificar a causa da mastite por meio de testes diagnósticos específicos, como a cultura microbiológica ou testes baseados em PCR.
Como diagnosticar as causas da mastite?
A identificação rápida e precisa das causas da mastite é um passo essencial para a tomada de decisões sobre o tratamento e as medidas de controle. O diagnóstico da mastite pode ser feito em nível de rebanho (uso de amostras de leite de tanque), vaca (amostras compostas dos quatro quartos) e de quarto mamário.
As amostras de leite de tanque representam o conjunto de leite de todas as vacas do rebanho e somente devem ser usadas para diagnóstico de mastite contagiosa (Strep. agalactiae, Staph. aureus, Mycoplasma), os quais são indicativos da presença de vacas com infecção por estes agentes. As amostras compostas e de quarto mamário devem ser coletadas de forma asséptica para evitar a contaminação por microrganismos da pele dos tetos, o que dificulta a interpretação dos resultados.
Tradicionalmente, o diagnóstico das causas da mastite tem sido feito pelo uso de microbiologia convencional, na qual as bactérias e outros microrganismos crescem em meios de cultura e podem ser identificados com base nas características bioquímicas ou de coloração (meios cromogênicos).
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Além da cultura microbiológica, a partir da década de 1980, surgiram os métodos de PCR (reação em cadeia da polimerase), que se baseiam na amplificação de uma região alvo do código genético do patógeno, que funciona como se fosse uma assinatura específica de cada espécie de microrganismo.
Desta forma, como são métodos diferentes e que podem ser usados em diferentes situações é importante conhecer as diferenças, vantagens, limitações e as interpretações de cada método, de modo a permitir uma correta tomada de decisões.
O que é a cultura microbiológica?
Os métodos de cultura microbiológica para diagnóstico de patógenos causadores de mastite se baseiam na inoculação da amostra estéril de leite (cerca de 10 microlitros) em meios de cultura específicos. Estes meios de cultura permitem o crescimento de colônias dos microrganismos, que podem então ser identificados por meios das características morfológicas, bioquímicas e de coloração das bactérias.
Mais recentemente, o uso de técnicas de espectrometria de massas MALDI-TOF, que identifica o perfil de proteínas ribossomais do patógeno, permite alta acurácia e rapidez (cerca de 24 hs) na obtenção de resultados de cultura microbiológica.
Desta forma, o diagnóstico pela cultura microbiológica permite identificar a presença de microrganismos vivos, o que é indicativo da causa da infecção da glândula mamária e tem sido considerado como o padrão ouro para o diagnóstico de infecções intramamárias.
Uma das limitações do uso da cultura microbiológica é a ocorrência de resultados negativos, que podem ocorrer pelo baixo número de bactérias no leite (< 100 ufc/ml), pela presença de bactérias mortas e quando o microrganismo em questão necessita de meios de cultura e condições laboratoriais específicos, como no caso de Mycoplasma.
Além disso, dependendo do laboratório e da logística de envio de amostra, os resultados somente são obtidos após alguns dias (3-5d). Ultimamente, o uso de sistemas de cultura microbiológica na fazenda tornou-se uma alternativa para reduzir o tempo de obtenção dos resultados, o que permite tomar decisões sobre tratamentos e outras medidas de controle de forma rápida (<24hs).
O que são as técnicas de PCR para diagnóstico da mastite?
A técnica de PCR indica se uma sequência de DNA alvo está presente na amostra de leite. De forma simples, a reação de PCR acontece quando condições favoráveis são ofertadas a enzima polimerase, o que proporciona uma simulação do que acontece in-vivo durante o processo de infecção, que nada mais é do que a multiplicação de cópias de DNA alvo do patógeno.
Num segundo passo, alta concentração de DNA alvo podem ser detectadas de forma convencional (gel de eletroforese) ou em tempo real (RT-PCR) de forma rápida possibilitando o diagnóstico do patógeno causador de mastite.
A maioria dos painéis comerciais é baseada no uso da multiplex PCR (um tipo de RT-PCR), em que várias sequências de DNA diferentes são amplificadas simultaneamente, o que possibilita saber se a infecção está sendo ocasionada por um dos principais patógenos causadores de mastite (por exemplo, Mycoplasma bovis, Staph. aureus, Strep. agalactiae, outros Streptococcus e alguns tipos de coliformes), utilizando apenas uma unica reacão de PCR.
Os resultados são expressos em Ct (cycle treshold), que representa o número de ciclos de PCR necessários para atingir o limite de detecção do sinal de fluorescência do teste. Quando maior a quantidade de DNA bacteriano na amostra de leite, menor é o Ct do teste. Deve-se destacar também que o teste de PCR indica a presença de DNA de um determinado patógeno, tanto de microrganismos vivos ou mortos.
De forma similar à cultura microbiológica, a correta coleta das amostras é fundamental para a interpretação dos resultados. Uma das vantagens diferenciais em relação à cultura microbiológica é que o uso da PCR em amostras estéreis apresenta maior sensibilidade e especificidade para detecção de agentes contagiosos do que a cultura microbiológica. Como a PCR apenas detecta a presença de DNA e não necessita dos microrganismos vivos, as amostras podem ter a adição de conservantes.
Uma das limitações do uso da PCR para diagnóstico da mastite é o uso de amostras de leite não estéreis (p.ex., amostras coletadas para análise de CCS), pois são amostras com alta contaminação do ambiente ou contaminação por bactérias contagiosas de vacas que foram ordenhadas anteriormente.
Este efeito de contaminação residual (chamado de ‘carry-over effect’) ocorre após a ordenha de vacas infectadas por bactérias contagiosas (Strep. agalactiae, Staph. aureus, Mycoplasma), o que contamina as teteiras, mangueiras, coletores de amostras e medidores de leite e tem alto risco de gerar resultados falso-positivos nas próximas vacas coletadas na mesma unidade de ordenha.
Um estudo (1) indicou que o efeito da contaminação cruzada de Staph. aureus ocorre quando são utilizadas amostras de leite não-estéril para diagnóstico por PCR, o que causa perda da acurácia e dificuldade de interpretação dos resultados.
Desta forma, nestas amostras não-estéreis, recomenda-se que a interpretação dos resultados de PCR deve levar em conta outras informações sobre a vaca (CCS, histórico de mastite clínica, ordem de coleta de leite durante a ordenha).
Para auxiliar na interpretação dos resultados de testes de PCR em amostras não-estéreis, o estudo recomenda três categorias de resultados:
- (A) alta chance de infecção por Staph. aureus (valores de Ct <32);
- (B) alta chance de negativo para Staph. aureus (Ct >37);
- (C) incerteza sobre resultado de infecção por Staph. aureus (Ct- de 32 a 37).
Além dos cuidados em relação à coleta das amostras, os testes de PCR indicam a presença ou não de DNA de um determinado patógeno, mas não indica se o patógeno está vivo ou morto, o que torna difícil o uso dos resultados para fins de tratamento.
Por exemplo, um estudo com infecção experimental com Staphylococcus spp. indicou que os testes de PCR conseguem detectar por vários dias este agente, mesmo quando a cultura microbiológica já indicou a cura do agente.
Além disso, uma limitação do teste PCR é que somente são identificados os patógenos incluídos no kit de diagnóstico, o que difere da cultura microbiológica na qual podem crescer quaisquer tipos de microrganismos viáveis. Finalmente, uma das principais limitações do uso de PCR para diagnóstico da mastite é o maior custo em relação à cultura microbiológica.Em relação à cultura microbiológica, a PCR tem menor tempo de análise (em cerca de 4-5 horas no laboratório) e tem maior sensibilidade e especificidade.
O uso de PCR para diagnóstico de mastite é indicado para fazendas com problemas de Mycoplasma, pois este microrganismo necessita de condições especiais de incubação e meio de cultura, além de ter crescimento lento, o que resulta em diagnóstico demorado pela cultura microbiológica.
Diferenças entre cultura microbiológica e testes de RT-PCR
Conhecer as características da cultura microbiológica e dos testes de PCR é fundamental para poder interpretar os resultados e considerar as vantagens, desvantagens e limitações de cada metodologia.
Fonte: MilkPoint
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